Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="> ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКОВ. МЕТОДЫ ОКРАСКИ. ">

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10- 15 мин в 5- 10% раствор хлористо-водородной кислоты и затем промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим способом: опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой; заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое кали или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в течение 30- 40

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="> Рецепты приготовления красителей Карболовый"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ "> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В левую руку берут пробирку со стерильным физическим раствором (дистиллированной водой) и помещают между 1 и 2 пальцами таким образом, что ладонь находится под пробиркой и горлышко пробирки направлено в зону спиртовки В правую берут бактериальную петлю, как карандаш Петлю фламбируют до покраснения сначала горизонтально, затем вертикально Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку физ. р-ра к ладони и осторожно вынимают е из пробирки. Движения должны быть плавными Горло пробирки обжигают в пламени и вводят петлю Берут выпускной петлей физ. р-р и выносят на стекло пару капель в границы мазка Закрывают пробку, предварительно проведя через пламя спиртовки пробку и горло пробирки одновременно Ставят пробирку в штатив

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt=">Схема приготовления мазка ">

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="> Методы окраски: Простые Сложные (Грам, Циль-Нильсен, Ожешко, Бури - Гинс). ">

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt=">При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt=">При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок. Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt=">отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ "> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt=">Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+"> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae "> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ "> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt=">ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt=">ОКРАСКА ПО БУРРИ И БУРРИ-ГИНСУ Капсула у Klebsiella pneumoniae ">

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при"> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt=">Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые

Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-

паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата состоит в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Далее препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества˸ спирты, кислоты, ацетон и др.
Размещено на реф.рф
С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять ᴇᴦο после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, в случае если бактериальная пленка (мазок) чересчур толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, в случае если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода . На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).

Сложные

Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие

(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

Окраска по Грамму.

1. Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:

Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).

Предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают

окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

Метод Циля-Нильсона:

Практическое применение : для диагностики заболеваний (туберкулез)

Вопрос 7. Клеточная стенка бактерий: особенности строения у грамположительных и грамотрицательных бактерий, функции, методы выявления. Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. L -формы бактерий.

Ответ:

Клеточная стенка. Располагается над ЦПМ.

КС обеспечивает постоянную форму клетки, механическую и осмотическую защиту, взаимосвязь с окружающей средой, несет рецепторы для бактериофагов.

Отдельные соединения в составе КС обладают целым спектром иммунобиологических свойств : участвуют в адгезии, угнетении фагоцитоза, обладают иммуномодулирующей активностью и т.д.

Химический состав и строение клеточной стенки постоянны и являются важным таксономическим признаком.

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Основа -пептидогликан , обеспечивающий ригидность и эластичность КС.

Структура: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных между собой посредством гликозидных связей.

К каждому остатку N-ацетилмурамовой кислоты присоединен короткий пептид из 4-5 аминокислот.

Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания: наличие аминокислот в D-форме (неприродная конфигурация) и высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Это имеет принципиальное значение для пространственной организации пептидогликана. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.

У грамположительных эубактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90%), у грамотрицательных - содержание пептидогликана значительно меньше (1-10%).

Функции клеточной стенки:

Обусловливает форму клетки.

Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.

Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.

Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.

Особенности строения КС Гр+

Клеточная стенка грамположительных бактерий достаточно плотно прилегает к ЦПМ.

Пептидные сшивки в пептидогликане обеспечивают его трехмерную пространственную организацию.

Многослойный пептидогликан пронизывают тейхоевые кислоты – полифосфатные соединения на основе рибитола или глицерина.

Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой (собственно тейхоевые или стеночные) или с гликолипидом ЦПМ (липотейхоевые).

Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, определяющего поверхностный заряд клетки.

Особенности строения КС Гр-

Пептидогликан образует только тонкий внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегающий к ЦПМ.

У большинства видов пептидогликан образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.

Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (ЛПС).

ЛПС сложного молекулярного строения, занимает около 30-40% поверхности наружной мембраны и является ее важнейшим компонентом.

Методом выявления клеточной стенки является метод Пешкова (КС –красная; цитоплазма –розовая), по Грамму-тип стоения клеточной стенки.

Метод выявления клеточной стенки: Метод Пешкова

Этапы окраски :

1.мазок протравливать в 10% растворе танина 6-8 мин

2.промыть водой

3.окрашивать водным раствором фуксина 30-60 сек

4.высушить

Сущность метода : танин уплотняет клеточную стенку бактерий, и большая часть фуксина задерживается в ней

Цель : выявление клеточной стенки. КС - красная, цитоплазма -розовая

Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена .

L-формы

Если бактерии частично или полностью утратили клеточную стенку, но сохранили способность к размножению, они называются L-формами.

L-формы бактерий образуются под воздействием препаратов, ингибирующих синтез пептидогликана (антибиотик пенициллин) или разрушающих пептидогликан (лизоцим).

Изучают L-формы в фазово-контрастном микроскопе

Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.

Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы(капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса (для окраски чистой культуры капсульных бактерий).

Метод выявления капсул: метод Бурри-Гинса

Цель метода : выявление капсулы у бактерий

Этапы окраски :

1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови

2.высушить и зафиксировать в пламени горелки

3.окрасить карболовым фуксином 1мин

4.высушить

Сущность метода : капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку

Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus

Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.

Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи (один жгутик),перитрихи (жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.

Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F -пили (половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка (адгезия).

Примеры бактерий: Половые пили Е. соli

Salmonella Typhi - перитрихи

Vibrio cholerae - монотрихи

Campylobacter jejuni - лофотрихи или амфитрихи

Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.

Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium . (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму).Высокая резистентность ,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.(на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).

Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.

Функции : участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.

Мезосомы - инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)

Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме

В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция: синтез белков

Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера(окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие ) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые , зерна волютина- темно-синий цвет , расположены на обоих концах клетки) .

Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.

Нуклеоид у прокариот - генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу

Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.

метод Романовского-Гимзы

Цель метода : выявление нуклеоида; нуклеоид - сине-фиолетовый; цитоплазма - розовая

Сущность метода : Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым

Этапы окраски :

1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании

2.промыть водой

3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин

4.высушить

14. Актиномицеты : морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.

Актиномицеты - группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением; гифы переплетаясь, образуют мицелий.

Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание - актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).

В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.

Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена

15. Микоплазмы : таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.

Ответ : Класс - Mollicutes

Порядок - Mycoplasmatales

Семейство - Mycoplasmataceae

Род - Mycoplasma

Микоплазмы - полиморфные микроорганизмы, отличающиеся от других прокариотов отсутствием клеточной стенки

Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, более прочная и эластичная (т.к. в ней присутствует холестерин). Клетки микоплазм содержат нуклеоид(самый маленький), рибосомы, цитоплазму и цпм (без мезосом). У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки (Mycoplasma pneumoniae) и нитчатые выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии.

Для культивирования микоплазм используют специальные полужидкие среды , на которых через 2-4 недели получают видимый рост в виде колоний, напоминающий "яичницу- глазунью"(из-за хрупкости микоплазм - т.к. Отсутствует клеточная стенка).Их изучают в нативных препаратах в фазово-контрастном микроскопе (не удается окрасить из-за хрупкости)

16. Риккетсии : таксономия, биологические свойства, морфологические формы, методы окраски, методы культивирования. Жизненный цикл риккетсий. Роль риккетсий в патологии человека (назовите заболевания и соответствующих им возбудителей).

Ответ : Царство - Bacteria

Порядок - Rickettsiales

Семейство - Rickettsiaceae

Род - Rickettsia

Риккетсии - грамотрицательные полиморфные бактериоподобные прокариоты,капсул,спор не образуют. Облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на простых питательных средах. Жизненный цикл риккетсий включет 2 стадии - вегетативную и покоящуюся . В вегетативной стадии риккетсии активно размножаются путем бинарного деления; покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью(меньших размеров, с утолщенной клеточной стенкой).

Различают 4 морфологические формы риккетсий (по Здродовскому ) :

Кокковидную (d= 0,3-0,4мкм)

Палочкивидную (1-2 мкм)

Бациллярную(3-5 мкм)

Нитевидную(до 40 мкм)

Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков возбудителей инфекций - вшей, блох, клещей. Для окраски риккетсий применяют сложные методы - Романовского-Гимзы и Здродовкого

Методика окраски :

1.фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают разведенным карболовым фуксином Циля(без нагревания)

2.промывают водой

3.обесцвечивают слабым раствором органической 0,5% лимонной к-ты, 0,15% уксусной к-ты или минеральной кислоты (0,01% HCL)

4.промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего

Результат окраски : риккетсии - в рубиново-красный; цитоплазма - голубая; ядро - синее

Патогенные для человека риккетсии являются возбудители риккетсиозов, для которых характерны сыпнотифозные или пятнистые лихорадки. Например, Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический вшивый сыпной тиф.

17. Хламидии : таксономия, морфология и ультраструктура, жизненный цикл. Методы выявления и культивирования. Роль в инфекционной патологии человека.

Ответ : Семейство - Chlamydiaceae

Род - Chlamydia

ЭТ - внеклеточная инфекционная частица (0,2-0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, рибосомы, жесткую клеточную стенку. ЭТ проникает в чувствительную клетку путем эндоцитоза, вокруг него образуется вакуоль. Внутри вакуоли ЭТ разбухает, приобретает сетчатую структуру, увеличивается до 0,5-1,5 мкм и превращается в РТ.

РТ внутри вакуоли многократно делится путем образование поперечных перегородок. Вакуоль заполняется микро-колониями хламидий, содержащих большое количество РТ в процессе деления, промежуточные тельца и ЭТ. Вакуоль превращается во внутриклеточное включение, покрытое оболочкой - хламидой, расположенное в цитоплазме клетки-хозяина. Выход хламидий из клетки - через неповрежденную мембрану или при гибели клетки. Освободившиеся ЭТ внедряются в другие здоровые клетки, где цикл развития повторяется.

Изучают хламидии в живом состоянии, в фазово-контрастном микроскопе и окрашивают методом Романовского-Гимзы (ЭТ - розовые, РТ - сине-голубые).

Патогенны: Chlamydia trachomatis (трахома и урогенитальные инфекции), Chlamydia pneumoniae (респираторные инфекции), Chlamydia psittaci (орнитоз).

18. Спирохеты : таксономия, биологические свойства, ультраструктура клетки, цисты. Методы изучения спирохет нативных и окрашенных препаратов. Роль спирохет в инфекционной патологии человека.

Семейство – Spirochaetaceae

Спирохеты - тонкие нитевидные, спирально извитые микроорганизмы, обладающие активной подвижностью. Относятся к грамотрицательным прокариотам. Клеточная стенка эластичная, что позволяет им совершать колебательные, вращательные и сгибательные движения.

Двигательный аппарат представляет собой фибриллярный тяж, состоящий из 2х пучков фибрилл, расположенных субтерминально на обоих концах клетки. Фибриллы пролегают в клеточной стенке, обвивая цитоплазматический цилиндр (протопласт). В середине клетки фибриллы перекрывают друг друга. Фибриллы состоят из белка флагеллина.

Спирохеты изучают в нативных препаратах, используя темно-польную микроскопию для выявления их форм и подвижности. Их Ультраструктуру изучают с помощью электронной микроскопии. Для изучения спирохет в окрашенном состоянии применяют: метод Романовского-Гимзы (боррелии в сине-фиолетовый, трепонемы в бледно-розовый, лептоспиры в красно-розовый), метод серебрения по Морозову (спирохеты имеют вид тесно-коричневых спиралей на светло-желтом фоне препарате),негативный способ Бурри (тушь не проникает тела микробов,на темном фоне белые контуры спирохет)

существенную роль в инфекционной патологии человека играют роды Treponema, Borrelia и Leptospira. Treponema pallidum - возбудитель сифилиса, Borrelia recurrentis - возбудитель возвратного тифа, Leptospira interrogans является возбудителем лептоспироза

19. Микроскопические грибы : морфология, ультраструктура. Размножение плесневых и дрожжевых грибов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.

Протопласты (содержимое клетки, заключенное в клеточную стенку) клетки грибов содержат ядро с ядрышком, митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, фагосомы, вакуоли и др. Снаружи протопласты покрыты ЦПМ с высоким содержанием стеролов (главным образом эргостерола) и плотной клеточной стенкой,в состав которой входят хитин, целлюлоза, глюкуроновая кислота, глюканы, различные углеводы, липиды, белки, пигменты.

По морфологическим особенностям грибы подразделяются на группы: плесневые грибы и дрожжеподобные грибы

Плесневые грибы образуют мицелий (тело гриба), который состоит из переплетенных гифов. На питательной среде плесневые грибы образуют субстратный мицелий, который прорастает в нее, извлекая из среды все необходимые для роста и размножения вещества, и воздушный мицелий,на котором созревают неполовые споры,с помощью которых грибы размножаются. Бесполовой путь у плесневых грибов характеризуется образованием большого количества экзоспор или эндоспор. Многие грибы могут размножаться и половыми спорами(половым путем).

Дрожжевые грибы размножаются почкованием.

Морфологию грибов изучают в нативных препаратах "раздавленная капля" в затемненном поле зрения, фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе и с помощью окраски простым методом, по Граму, Цилю-Нильсену,Нейссеру

Заболевания вызываемые микроскопическими грибами - микозы.Грибковое заболевание Кандидоз - вызывается Candida albicans

РАЗДЕЛ ФИЗИОЛОГИЯ.

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити. И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов. У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Толщина оболочки клеток, оставшихся бесцветными, не позволяет краске проникнуть внутрь, и она легко смывается с поверхности бактерий. Последним шагом окрашивания по Граму является использование красного красителя, он остается на поверхности клеточной мембраны и придает ей розовый или красный оттенок.

Грамположительные бактерии, как правило, опасны для человека. К этой категории относятся стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии и т. д. Грамотрицательные не настолько опасны. Они тоже могут вызывать болезни и воспаления, но только при определенных условиях. Таким образом, просто приготовив окрашенный препарат, можно получить представление о степени опасности исследуемых микроорганизмов.

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Витальный метод, безусловно, самый опасный, так как исследователям приходится иметь дело с живыми клетками, иногда представляющими смертельную опасность. Однако именно такой способ дает возможность изучать не только строение клетки, но и весь ее жизненный цикл и взаимодействие с окружением.

Для многих микробиологических исследований важно сохранить бактерии живыми. Это значит, что нужно использовать специальные нетоксичные или низкотоксичные красители, к тому же легко проникающие в структуру клетки через наружную оболочку. Это так называемые витальные красители, они могут быть предназначены для видимого света или флуоресцентными. По химическому составу красители разделяются на:

• основные (акридиновый оранжевый, метиленовый синий);
• кислотные или кислые (индигокармин, кислый фуксин);
• нейтральные (родамин В).

Работа с фиксированными препаратами

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Особенно важны сложные методы для диагностики инфекционных заболеваний, например, способ окраски Нейссера помогает отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийных.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Кроме того, капсулы мягкие и непрочные, при окраске они могут потерять форму. Красящие вещества плохо взаимодействуют с желеобразной структурой капсул и легко вымываются при обработке. Чтобы обнаружить, но не повредить капсулы, пригодится негативный способ окрашивания.

Одним из способов выявления капсул является метод окрашивания по Гинсу. Каплю черной туши наносят на край предметного стекла, вносят в нее исследуемый материал, перемешивают и распределяют по всей поверхности. Мазок сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают фуксином Циля. Через 2-3 минуты промывают водой и высушивают. В результате под микроскопом на общем темном фоне отчетливо просматриваются розовые клетки, окруженные прозрачными капсулами.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Перед началом окрашивания приходится химически обрабатывать поверхность спор, чтобы она немного изменила свою структуру и позволила красящим веществам проникнуть внутрь. При этом окрашивается и вся цитоплазма клетки. Чтобы обесцветить цитоплазму, препарат промывают и высушивают. Краска в спорах, благодаря их более плотной структуре задерживается лучше, чем в цитоплазме.

Способы окраски спор могут быть разными, например, Ожешко или Циля – Нильсена, но все они сводятся к одной схеме:

• разрыхление поверхности спор химическими веществами (кислоты, аммиак, едкий натр);
• окрашивание клетки со спорой (обычно при нагревании);
• обесцвечивание цитоплазмы.

В результате получаем отлично видимую ярко окрашенную спору и бледную, почти прозрачную цитоплазму.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

При подготовке микроорганизмов к исследованию бактериальную культуру несколько раз пересеивают на свежую питательную среду в течение нескольких дней. Затем бактерии со жгутиками переносят в пробирку со стерильной водой (t 37⁰С). Делают это предельно осторожно, не перемешивая жидкость, чтобы не повредить жгутики.

Содержимое пробирки оставляют примерно на час, чтобы бактерии равномерно распределились по всему объему. Перед началом исследования проверяют подвижность клеток в висячей капле. Если движения нет, пробирку оставляют еще на некоторое время.

При нанесении раствора на предметное стекло клетки могут легко потерять жгутики. Поэтому поверхность стекла должна быть идеально чистой и обезжиренной. Перед нанесением капель раствора предметное стекло проводят над горячей частью пламени горелки, чтобы попавшие на поверхность капли расплылись и быстро высохли.

После высыхания мазок протравливают, через 15 минут химикат смывают. Следующий этап – окраску фуксином – проводят, погружая стекло в раствор красителя, чтобы не повредить жгутики при нанесении краски.

Выдержав нужное время, мазок промывают водой и высушивают. Теперь можно переходить к исследованию получившегося результата.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

После высыхания (обычно естественным путем) полученный результат можно использовать по назначению.

Окрашивание микроорганизмов – это целая система методов, приемов, схем, направленных на обнаружение и распознавание клеток при помощи микроскопа. Ни одно медицинское исследование или научная работа в микробиологии не обходятся без предварительной подготовки и окраски изучаемого материала.