Среды классифицируют по консистенции, составу, происхождению, назначению и загрязнённости материала.

При классификации питательных сред по консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие.
При классификации питательных сред по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.
При классификации питательных сред по происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).

Искусственные питательные среды для бактерий

Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

Естественные среды для выращивания бактерий

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения. По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды дм выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Классификации питательных сред по загрязнённости материала

Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды . При обильной контаминации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчений идентификации) среды .

МГАВМиБ им. К.И. Скрябина

Кафедра микробиологии и

иммунологии

Руководитель Бурлакова Г.И.

Р Е Ф Е Р А Т

Питательные среды и их классификация

Выполнен студенткой

II курса 1-й группы ФВМ

Куринновой С.В.

Москва-2007 г.

1. Введение……………………………………………………………….2

2. Культивирование микроорганизмов………………………………...2

3. Классификация питательных сред и способы их получения………3

4. Культивирование грибов……………………………………………..7

5. Вывод…………………………………………………………………..8

6. Список использованной литературы…………………………………9

1. Введение.

Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и дыхания. В зависимости от типа питания микробы подразделяют на аутотрофы (способные усваивать углерод из СО 2 , а также молекулярный азот из воздуха, а минеральные вещества путём хемо- или фотосинтеза) и гетеротрофы (способны усваивать углерод и другие вещества только из готовых органических соединений). К аутотрофам относятся в основном многие почвенные бактерии, к гетеротрофам (параторофам) – микробы инфекционных болезней животных и растений.

Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий культивирования микробов invitro.

2. Культивирование микроорганизмов .

Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно создавать условия для их роста и размножения invitro, взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса. Рост и размножение –циклический 4-х фазный процесс (латентная, логарифмического роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба, влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации.

Для культивирования invitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты – плотные или жидкие – называют культуральными или питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях микроорганизмы культивируют invitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других сосудах.

К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:

1). Стерильность и по возможности прозрачность.

2). При составлении питательных сред учитывают потребность микроорганизмов в элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы – источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы – доступные для усвоения микроорганизмами).

3). Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (a w ), осмотического давления.

3. Классификация питательных сред и способы их получения.

В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента, необходимого для его жизнедеятельности – дефицитной .

Питательные среды классифицируют в зависимости от:

Химического состава и исходных компонентов;

Консистенции;

· целевого назначения.

В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред:

- среды неопределенного химического состава (естественные или натуральные среды) – это среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химических состав:

1) среды животного происхождения (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.)

2) среды растительного происхождения (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.д.)

На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества, образующие микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

«Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ).

Среды известного химического состава (синтетические) – в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и, исходя из этого, создать минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его размножения химические соединения.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды . Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей -агар-агар или желатину.

Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких –0,3-0,7%.

Желатина – кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения.

По целевому назначению различают:

А).Общеупотребительные (основные) среды.

Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.

Мясная вода: Получение – мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч., затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям, плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120 О С 20 мин.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45 О С, добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают, добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют автоклавированием при 120 0 С 20 мин.

Мясо–пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na 2 CO 3 , фильтруют и через воронки разливают в пробирки, стерилизуют автоклавированием при120 0 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно автоклавированием при 120 0 С при 1 атм. течение 20 мин.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют автоклавированием.

Бульон Хоттингера : основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят 150-20 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют автоклавированием при 120 0 20 мин.

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.

Питательный бульон содержит: триптический гидролизат кильки –10,05, NaCI- 4,95. 15 г порошка этого бульона растворяют а 1 л дист. Воды, кипятят 2 мин, фильтруют, разливают по емкостям и стерилизуют а автоклаве при 120 0 С 20 мин (Ph 7,3).

Питательные среды классифицируются по происхождению, консистенции, составу, целевому назначению.

А. По происхождению питательные среды делятся на естественные, искусственные, синтетические.

Естественными питательные среды называются в тех случаях, когда для выращивания микроорганизмов используются натуральные продукты (молоко, свернутая сыворотка и др.).

Искусственные питательные среды – это среды, которые готовятся по специальным прописям из различных продуктов, например, мясо-пептонный агар (МПА) или мясо-пептонный бульон (МПБ).

И естественные, и искусственные среды могут быть растительного (картофельная среда) или животного(молочные, мясные среды) происхождения.

Синтетическими питательными средами называются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Синтетические среды используются, когда выращиваемую бактериальную клеточную массу необходимо освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных питательных сред.

Например, синтетические среды необходимы при получении бактериальных аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизмов. Преимущество таких питательных сред состоит в том, что они легко воспроизводимы, так как имеют постоянный состав.

Б. По консистенции различают питательные среды жидкие, полужидкие и плотные.

Жидкие среды готовят, используя экстракты, растворы, гидролизаты различных исходных продуктов. Таким образом, вещества, необходимые для питания бактерий, находятся в растворенном состоянии. (Примеры: МПБ, солевой бульон и др.).

Полужидкие среды готовятся на основе жидких с добавлением в их состав 0,2-1% агара-агара или другого уплотнителя. Уплотнители – вещества, придающие средам требуемую консистенцию. В качестве уплотнителя чаще всего используется агар-агар (по-малайски – желе) – это полисахарид - продукт переработки некоторых морских водорослей; он плавится при температуре 80-86 о С, а затвердевает при 40 о С). Желатина тоже является уплотнителем; она представляет собой экстракт из тканей, содержащих много коллагена (костной или хрящевой). Желатину добавляют в питательные среды в количестве 10-22%. Температура плавления желатины – 25 о С, что делает её неудобной для выращивания большинства микроорганизмов; оптимальная температура культивирования которых составляет 37 о С.

Кроме того, некоторые бактерии выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину.

Плотные питательные среды тоже готовятся на основе жидких, но содержащие агар-агара должно быть не менее 1,5-2%. (Примеры: МПА, сахарный агар).

Таким образом, консистенция питательных сред определяется количеством содержащихся в их составе агара-агара.

В. По составу питательные среды могут быть простыми и сложными.

Простые содержат минимальное количество компонентов (например: МПБ, МПА).

Сложные готовятся путём добавления к простым определённых дополнительных компонентов (крови, сыворотки, глюкозы и др.).

Г. По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективно-селективные, дифференциально-диагностические, транспортные.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий (примеры МПА, МПБ).

Элективно-селективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определённого вида (или определённой группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При этом состав сред определяется биологическими особенностями, по которым данный микроорганизм отличается от большинства других. Компоненты таких питательных сред обеспечивают преимущественный рост искомых микроорганизмов и (или) подавление в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры.

По консистенции эти среды могут быть жидкими(например: 1% пептонная вода для выделения холерного вибриона) или твёрдыми (желточно-солевой агар для выделения стафилококков).

Дифференциально-диагностические среды предназначены для разграничения отдельных видов или типов микроорганизмов.

Состав таких питательных сред основан на том, что отдельные виды (или типы) бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав таких сред входит обычно:

Ÿ питательная основа (МПБ или МПА), обеспечивающая рост изучаемых микроорганизмов;

Ÿ субстат, выявляющий наличие ферментов (например, лактоза, глюкоза);

Ÿ индикатор. Индикаторы – это вещества, меняющие свой цвет в зависимости от рН среды. Их используют не только для определения кислотности среды, но и вводят в состав питательной среды для выявления биохимических свойств микробов.

Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щёлочи в результате ферментативной деятельности микробов (например: индикатор Андреде в кислой среде имеет красную окраску, при нейтральном значении рН-бесцветную; аналогичным образом действует индикатор фуксин).

Примеры дифференциально-диагностических сред: среда Эндо, позволяющая отличать лактозоположительные и лактозоотрицательные энтеробактерии; жидкая среда Раппопорт, выявляющая различия тифозных и паратифозных бактерий и многие другие.

Выделяют транспортные среды (консервирующие) , которые используются для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. Они предотвращают отмирание патогенных микроорганизмов и способствуют подавлению сапрофитов. К этой группе относятся: глицериновая смесь, глицериновый консервант с солями лития и др.

Приведённая классификация в большой степени условна, так как некоторые среды могут быть одновременно и дифференциально-диагностическими, и селективными (например, среда Плоскирева, ЖСА и другие).

В настоящее время в лабораторной практике часто используются сухие питательные среды, которые выпускаются в виде полуфабрикатов. Для их производства используется рентабельное непищевое сырьё, отходы мясной и рыбной промышленности. Применение сухих сред избавляет лаборатории от трудоёмкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сопоставимые результаты в разных лабораториях и приближает к разрешению вопроса о стандартизации питательных сред. Технология приготовления таких сред проста, она указана на этикетке. Сухие питательные среды удобны в транспортировке и хранении.

Классификация питательных сред:

Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. Например: овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца и т.д. (МПА, МПБ).

Полусинтетические – в состав входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава. Например: МПБ с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро.

Синтетические – содержат только химически чистые соединения в точных концентрациях. Применяют в лабораторных экспериментах. Например: среда Чапека, Омелянского, Ушинского и т.д.

Назначение питательных сред

Универсальные (общего назначения)- пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда.

Специальные применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие.

1. Элективные среды - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.

2. Селективные - благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).

3. Дифференциально-диагностические - группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).

4. Консервирующие (траспортные)-

предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия

биоматериала до посева для диагностики

Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов

Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов

Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения

Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)

Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред

Транспортная система со средой Стюарта

Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.

Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.

Транспортная система со средой Кери Блэйр

Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.

Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,

удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.

Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp .

Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.

Транспортная система со средой Эймса

Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets .) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.

Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.

В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.

Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.

Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)

Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.

Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.

Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера

Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.

Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.

Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона

Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.

Среда МакКонки

Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.

Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.

Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.

Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.

Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо

Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.

Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.

Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар

Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.

Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.

Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.

Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар

Селективная среда для выделения сальмонелл.

Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.

Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.

Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.

Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.

Специальные элективные среды: Среда Леффлера

Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.

Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.

Специальные селективные среды: Кампилобакагар

Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.

Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni .

Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.

Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.

Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.

На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение

Мясопептонный бульон и мясопептонный агар являются пригодными для большинства бактерий наиболее простыми питательными средами. Исходным материалом для приготовления этих и ряда других питательных сред служит мясная вода, представляющая собой желтоватую прозрачную жидкость с кислой реакцией. Мясная вода содержит растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли.

Мясная вода и концентрированный мясопептонный бульон (по ГОСТу 10444-63)

Мясо говяжье или конское после удаления костей, жира и сухожилий пропускают через мясорубку, и фарш заливают холодной водопроводной водой, вливая на каждые 500 г мясного фарша 1 л воды. После перемешивания смесь медленно нагревают до кипения и умеренное кипение поддерживают в течение 1,5 ч. Небольшое количество смеси фарша с водой (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания мелких частичек мяса.

Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Готовность мясной воды определяют фильтрованием небольшого количества ее в пробирку через бумажный фильтр. Если фильтрат прозрачен, мясная вода готова. Если же фильтрат получается мутным, то варку следует производить до тех пор, пока не получится вполне прозрачный фильтрат. После окончания варки жидкость отцеживают через полотно или вдвое сложенную марлю, отжимают из вареного мяса весь сок и полученную жидкость доводят кипяченой водой до первоначального объема. Добавления большого количества воды обычно не требуется, так как в результате варки в мясную воду переходит много сока из мяса. Только при слишком длительной варке и очень бурном кипении наблюдается большое выпаривание жидкости.

Полученную мясную воду разливают в стеклянные пол-литровые банки, закатывают и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С. Из заготовленной таким образом мясной воды по мере надобности приготовляют необходимые питательные среды.

Чтобы получить концентрированный мясопептонный бульон (МПБ), к 1 л мясной воды прибавляют 10 г пептона1 и 5 г хлористого натрия. Доводят реакцию среды до pH 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистые пробирки и, закрыв ватными пробками, стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 120 °С.

Разведенный мясопептонный бульон

Приготовление мясной воды производится так же, как и для концентрированного бульона, но вместо 500 г мясного фарша берется 250 г его на 1 л воды. Можно заготовленную концентрированную мясную воду развести вдвое водой. К 1 л разведенной мясной воды добавляют 5 г пептона, 2,5 г хлористого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, а далее поступают так же, как при приготовлении концентрированного мясопептонного бульона.

Рыбопептонный бульон

На заводах, вырабатывающих рыбные консервы, вместо мясной воды для приготовления сред можно пользоваться рыбной водой. Рыбную воду следует готовить из крупной тощей рыбы. Лучше всего для этой цели подходит судак, треска или щука. Освобожденную от костей и жира рыбу пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г рыбного фарша. Все дальнейшие операции приготовления рыбной воды аналогичны операциям приготовления мясной воды.

Рыбная вода используется для приготовления рыбопептонного бульона. На 1 л рыбной воды прибавляют 10 г пептона, 5 г поваренной соли, нейтрализуют до pH 7,0-7,2 и стерилизуют так же, как мясопептонный бульон.

Розлив бульона в пробирки (перед стерилизацией) производится через стеклянную воронку, на конец которой надета резиновая трубка с наконечником и зажимом Мора (рис. 52). Стеклянный наконечник следует несколько погружать при розливе в пробирку, чтобы края пробирки не смачивались бульоном, иначе ватная пробка присохнет к стеклу и может прорасти микроорганизмами.

Установление реакции питательных сред

При микробиологических исследованиях постоянно приходится учитывать кислотные и щелочные свойства питательных сред. Активная кислотность питательного субстрата имеет, как уже указывалось, большое значение в жизненных процессах микробов: она влияет на их рост, морфологические и физиологические свойства. Для большинства бактерий необходима среда с pH 7,2-7,4, для дрожжей и плесеней - с pH 4,5-5,5.

Питательные среды, приготовляемые для выявления биохимических свойств микробов, должны иметь оптимальную, строго определенную для данного микроба реакцию. Установить pH приготовленной среды в микробиологической лаборатории можно либо электрометрическим, либо колориметрическим методами. Электрометрически pH определяют с помощью лабораторного рН-метра (например, ЛП-58 - рис. 53) или иономера (КФВ-И1 - рис. 54).

Чтобы измерить величину pH исследуемой питательной среды с помощью иономера, в прилагаемый к нему стаканчик наливают около 40 мл этой среды, погружают в нее патрон с хлор-серебряным полуэлементом и присоединяют электродное устройство. Стрелки гальванометра отклоняются и показывают значение величины pH.

При использовании лабораторного рН-метра (ЛП-58) удобнее применять стеклянный и каломельный электроды. Шарик стеклянного электрода имеет очень тонкие стенки - 0,03-0,05 мм, поэтому при работе с ним нужно соблюдать осторожность. Перед применением стеклянный электрод следует не менее 1-2 ч выдерживать в дистиллированной воде, а при частой эксплуатации нужно постоянно хранить его в дистиллированной воде, периодически заменяя ее свежей.

Перед измерением pH стеклянным электродом производят корректировку шкалы pH по буферному раствору. Величина pH буферного раствора должна быть близка к pH исследуемого раствора. Температурный компенсатор прибора устанавливают на температуру буферного раствора и настраивают усилитель и потенциометрическую часть прибора по нормальному элементу. Затем, промыв дистиллированной водой электроды и измерительный сосуд, наполняют его исследуемой средой и производят измерение pH среды; устанавливая температурный компенсатор на температуру среды и нажимая кнопку для включения прибора на фронтальной доске рН-метра, замечают показания стрелки гальванометра на шкале pH. Подробно правила пользования, настройки и ухода за приборами описываются в инструкциях, прилагаемых к приборам. Длительность анализа 3-5 мин. Результаты достаточно точны.

Электрометрически с помощью рН-метра и иономера, очень удобно проверять pH готовых сред. А так как при изготовлении питательных субстратов для бактериологических анализов приходится не только фиксировать имеющийся уровень pH среды, но и доводить реакцию до определенного его значения, то в практике оказался более удобным колориметрический метод.

В основу колориметрического метода положено свойство индикаторов менять свою окраску с изменением концентрации ионов H- растворов. Для каждого индикатора характерен свой диапазон pH, в пределах которого меняется его цвет. Согласно ГОСТу 10444-63 для установления pH питательных сред применяют 0,04%-ный раствор бромтимолового синего. Диапазон бромтимолового синего 6,0-7,6. В кислых средах он приобретает желтую окраску, в щелочных - синюю. При pH 7,1 дает салатово-зеленую окраску.

Для определения реакции среды или консервов после развития в них микроорганизмов применяют 0,04%-ный раствор бромкрезолпурпура. Бромкрезолпурпур изменяет окраску в диапазоне pH 5,2-6,3. В кислых средах он бледно-желтый, в нейтральных - красно-фиолетовый, а при pH 6,3 дает зеленую с пурпурным оттенком окраску.

Индикаторы готовят следующим образом: 0,1 г соответствующего индикатора, взвешенного на аналитических весах, растирают в ступке (желательно агатовой) с 1/20 н. раствором едкого натра. Для растворения 0,1 г бромтимолового синего берут 3,2 мл 1/20 н. раствора NaOH; для растворения 0,1 г бромкрезолпурпура - 3,7 мл 1/20 н. раствора щелочи. К полученному щелочному раствору добавляют 250 мл дистиллированной воды и получают 0,04%-ный раствор индикатора. Приготовленный раствор индикатора следует хранить на холоду в стеклянных сосудах с притертой пробкой.

Перед стерилизацией pH среды доводят до необходимого уровня (7,0-7,2). Для этого в большую колбу (2-3 л) вливают 1,5 л приготовляемой питательной среды. Из бюретки в нее начинают приливать по каплям 10%-ный раствор двууглекислой соды или слабый раствор щелочи (например, 0,1 н. раствор едкого натра), все время проверяя реакцию среды по индикатору (в данном случае по бромтимоловому синему). Для этого на белую фарфоровую плитку (можно даже кафельную) наносят несколько капель среды, в которые добавляют каплю индикатора. Если бромтимоловый синий при этом даст желтую окраску, то приливание соды или щелочи нужно продолжать до тех пор, пока среда от капли индикатора не окрасится в салатово-зеленый цвет. Если в капле исследуемой среды при внесении индикатора появляется зелено-синий тон, то щелочной раствор при титровании прилит в избытке и в колбу со средой следует добавить свежую, еще не титрованную питательную среду и опять проверить реакцию.

Прекрасно зарекомендовал себя на практике с помощью компаратора и стандартной шкалы Михаэлиса. Этот метод является достаточно точным - реакция среды определяется до 0,1 единицы pH. Для определения pH среды с помощью прибора Михаэлиса необходимо предварительно проверить реакцию среды с помощью лакмусовой бумажки, чтобы знать, каким индикатором и каким рядом ампул из прибора Михаэлиса следует воспользоваться. Так как для большинства питательных сред необходима нейтральная и слабощелочная реакция (pH 7,0-7,2), то из прибора нужно брать индикатор метанитрофенол и ряд ампул с pH 6,8-8,2. При стерилизации pH субстрата обычно снижается на 0,2 единицы, поэтому для создания оптимальных условий для роста микроорганизмов перед стерилизацией приготовляемая среда должна иметь pH 7,2-7,4.

После проверки реакции среды по лакмусу и подбора индикатора берут компаратор, устанавливают в него, пробирки и стандартные ампулы с соответствующим pH (рис. 55). Во вторую пробирку первого ряда (№ 2) в компараторе вливают 2 мл исследуемой питательной среды; сюда же добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,3%-ного раствора избранного индикатора (обычно, как уже сказано, метанитрофенола). В две крайние пробирки первого ряда № 1 и 3 вливается по 2 мл питательной среды и по 5 мл дистиллированной воды. В среднюю пробирку второго ряда № 5 помещают только 7 мл дистиллированной воды. В два крайних гнезда второго ряда компаратора № 4 и 6 вставляются ампулы со стандартным раствором с показателями pH, в интервале между которыми устанавливается реакция среды.

Рассматривая пробирки на свет через нижнее отверстие в компараторе на фоне белой матовой пластинки, сравнивают окраску исследуемой жидкости с окраской индикатора. Если окраска в пробирке со средой совпадает с окраской индикатора в одной из ампул, то величина pH среды будет равна значению pH данной стандартной ампулы. Если же цвет исследуемой среды (во второй пробирке) окажется более светлым, чем в стандартной ампуле, то в пробирку со средой по каплям добавляют 10%-ный раствор двууглекислой соды или 0,1 н. раствор едкого натра, используя для этой цели микробюретку. Приливание нейтрализующих растворов по каплям продолжают до тех пор, пока цвет в пробирке не сравняется с цветом в одной из ампул. По количеству миллилитров соды или щелочи, израсходованной на нейтрализацию 2 мл среды (помещенных в пробирку № 2), нетрудно подсчитать, какое количество миллилитров нейтрализующего раствора потребуется для установления уровня pH во всем объеме приготовляемой питательной среды.

В очень кислых средах величину pH определяют с помощью индикатора пара-нитрофенола. Растворы применяемых индикаторов готовят следующим образом.

1. 0,3 г мета-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 6,8 до 8,4).

2. 0,1 г пара-нитрофенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды (интервал значений pH от 5,4 до 7,0).

Установить приблизительное значение pH среды можно также с помощью универсального индикатора. Для этого в фарфоровую чашку наливают 2-3 мл исследуемой среды и приливают 2-3 капли универсального индикатора. Размешав смесь стеклянной палочкой, сравнивают ее цвет с окраской полос на цветной бумажной шкале. pH исследуемой среды будет такой же, какой указан у равноокрашенной полоски цветной шкалы. Степень точности определения pH универсальным индикатором около 0,5.

Приготовление мясопептонного агара (МПА)

Агар (по-малайски «желе») - сложное органическое вещество, получаемое из морских водорослей. По химическому составу он представляет собой смесь углеводов, относящихся к полисахаридам - производным галактозы - и обладающих желирующей способностью. Добавленный к жидкой среде агар придает ей такую плотность, что расплавление ее наступает лишь при температуре кипения. Плавится агар в воде примерно при 80-86 °С, затвердевает при 36-40 °С. Благодаря этому на агаровых средах можно выращивать культуры микробов при любой температуре, допускающей их жизнь.

Мясопептонный агар готовят из концентрированного мясопептонного бульона. В большую эрленмейеровскую колбу из тугоплавкового стекла емкостью до 2 л, снабженную ватной пробкой, вливают концентрированный мясопептонный бульон, добавляют от 2 до 4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агара и, не закрывая пробкой, ставят на слабый огонь для расплавления.

Мясопептонный бульон нужно брать с реакцией среды 7,4, потому что при стерилизации pH снизится на 0,2. Реакцию мясопептонного агара можно установить после того, как произойдет полное расплавление. Если агар хорошего качества и не дает осадка, то после установления pH его кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату и, разлив в колбы или пробирки (в зависимости от надобности), стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С.

Если агар недостаточно очищен, он может дать осадок. В этом случае до стерилизации мясопептонный агар следует осветлить. Для этого к расплавленному и охлажденному до 50 °С мясопептонному агару прибавляют яичный белок, смешанный с 30 мл воды и взбитый до состояния пены. На 1 л среды берут белок одного куриного яйца. Агар тщательно взбалтывают с введенным белком и ставят в автоклав на 10 мин при 120°С. Во время кипения белок свертывается и увлекает с собой все взвешенные частицы. После автоклавирования агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для этого берут стеклянную воронку большого диаметра, натягивают на нее марлю, а сверху кладут тонкий слой ваты. Фильтровать кипящий агар нужно быстро и фильтрат до застывания разлить в пробирки по 5-10 мл. Стерилизацию среды проводят в автоклаве, как указано выше.

После стерилизации пробирки со средой, содержащие по 5 мл агара, ставят в наклонное положение, так чтобы агар не касался пробки. После застывания получают «косой» (или скошенный) агар. Пробирки с 10 мл агара помещают в штатив и дают застыть, получая среду, разлитую на «высокий столбик». Косой агар хранить более 4-7 дней не рекомендуется, так как он высыхает.

Мясопептонный агар - основная питательная среда, используемая при бактериологических анализах в микробиологических лабораториях. Его используют как в виде «простого агара», так: и после добавления углеводов, приготовляя сложные дифференциально-диагностические среды.